為保證PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確及可靠性,專業(yè)的PCR實(shí)驗(yàn)(比如臨床PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室)室有四區(qū)隔離(或至少是三區(qū)隔離)的要求,常見的三區(qū)指的是:
1、試劑配制區(qū):PCR反應(yīng)體系的配制區(qū)域。
2、標(biāo)本處理區(qū):包括擴(kuò)增模板的制備,也就是我們常常提取DNA的地方;
3、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū):進(jìn)行PCR擴(kuò)增的區(qū)域,也是擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析的區(qū)域。
此外,如果將PCR擴(kuò)增區(qū)域和產(chǎn)物分析區(qū)再次分開,就是四區(qū)隔離了。
四區(qū)隔離,主要目的是防止氣溶膠在各個(gè)PCR區(qū)域之間的流動(dòng)—最好的方法是干脆每個(gè)區(qū)域隔一幢樓,那肯定是最佳的隔離措施了,但操作起來肯定不現(xiàn)實(shí),于是便有了針對(duì)不同區(qū)域設(shè)置正負(fù)壓的方法:
試劑配制區(qū)(Ⅰ區(qū)):最潔凈的區(qū)域,保持微正壓使得外界空氣無法進(jìn)入隔離污染源。并且陰性模板應(yīng)該在此區(qū)加入PCR管并蓋蓋,嚴(yán)禁在此區(qū)域打開、存放裝有DNA模板的離心管;
DNA模板添加區(qū)(Ⅱ區(qū)):保持微負(fù)壓,保證內(nèi)部空氣不外泄,以免陽(yáng)性模板的氣溶膠對(duì)外界環(huán)境造成污染。
擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物分析區(qū)(Ⅲ區(qū)):保持微負(fù)壓,使得內(nèi)部空氣不外泄,以免擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠對(duì)外界環(huán)境造成污染。操作時(shí)遵循Ⅰ區(qū)→Ⅱ區(qū)→Ⅲ區(qū)單一方向進(jìn)行,不可逆向進(jìn)行。
對(duì)于科研用途的PCR實(shí)驗(yàn)室,如果無法達(dá)到嚴(yán)格的三區(qū)隔離的要求,至少也要做到兩區(qū)隔離:即正壓區(qū)和負(fù)壓區(qū)。正壓區(qū)實(shí)施Ⅰ區(qū)的功能,負(fù)壓區(qū)實(shí)施Ⅱ區(qū),Ⅲ區(qū)的功能。
最忌諱也是最可怕的是反過來,在正壓區(qū)實(shí)施Ⅲ區(qū)的功能。PCR實(shí)驗(yàn)室不同區(qū)域間的空氣是-互相之間有流通是關(guān)鍵所在。
如果有問,我們的實(shí)驗(yàn)室沒有正負(fù)壓的區(qū)分,或者是全負(fù)壓,全正壓怎么辦呢?那我們的建議是:別怕麻煩,找個(gè)遠(yuǎn)離Ⅲ區(qū)(通俗地講就是打開PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的蓋子區(qū)域,比如電泳區(qū))的實(shí)驗(yàn)室當(dāng)做PCR I區(qū)使用,能省掉后續(xù)更多的麻煩。
既然PCR三區(qū)隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流,請(qǐng)注意以下細(xì)節(jié),思考一下氣溶膠來自哪里:
1. 每個(gè)區(qū)域都應(yīng)配備專用的移液器,不可交叉混用。
2. 每個(gè)區(qū)域都應(yīng)配備專用的移液器吸頭,不可交叉混用。
3. 如果條件允許,在PCRⅢ區(qū)工作結(jié)束后再次進(jìn)入PCR I區(qū)需要更換實(shí)驗(yàn)服、一次性鞋套、帽子、手套。
4. 在PCR I區(qū)、PCRⅡ區(qū)配備帶濾芯吸頭。
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